| الوصف: |
Dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine Herzmuskelerkrankung, bei der die Herzkammern dünner werden und das Herz größer wird. Dieses Phänomen führt z. B. zu Versagen des Herzens. Die Ursache dieser Erkrankung ist immer noch unbekannt. Forschern vermuten jedoch, dass sie entweder vererbt wird oder die Folge einer anderen Erkrankung ist, die einen Patient bereits hatte. Daher werden dringend Modellsysteme zur Rekapitulation der Krankheit benötigt, um die Krankheitsmechanismen und mögliche therapeutische Strategien zu untersuchen. Ziel dieser Bachelorarbeit war es, eine Mutation, die eine dilatative Kardiomyopathie (DCM) verursacht, in bereits erzeugte pluripotente Stammzellen (iPSCs) einzubringen und zu sehen, ob die Mutation erfolgreich durchgeführt werden konnte oder nicht. Die Missense-Mutation D94A wurde in die Myosin-regulatorische leichte Kette 2 (MYL2) der iPSCs eingeführt, um DCM-iPSC mithilfe von CRISPR-Cas9 zu erzeugen, wobei drei Arten von CRISPR, CRISPR 15 und 16 mit Non homologous end-joining (NHEJ) und DX1 mit Ultramer Vorlagen und Donor-plasmid, pGEM t easy mit homologer Reparatur (HDR) verwendet wurden. Am Ende brachten CRISPR 15 und 16 mit NHEJ und CRISPR-DX1 + Ultramere mit HDR keine erfolgreichen Ergebnisse, während CRISPR-DX1 + Donor-plasmid das erfolgreiche Ergebnis brachten. Die hergestellten DCM-iPSCs werden gereinigt und für zukünftige Experimente verwendet, um den potenziellen DCM-Phänotyp in Kardiomyozyten zu untersuchen, die aus diesen iPSCs stammen. Dilated cardiomyopathy (DCM) is a heart muscle disease, where the heart chamber becomes thin and the heart grows larger. This condition can result in heart failure. The cause of this condition is still unknown, however researchers claim that this is either inherited or the result of another condition which a patient already had, therefore model systems for recapitulating the disease are urgently needed to study the disease mechanisms and potential therapeutic strategies. The purpose of this bachelor thesis was to introduce a DCM-causing missense mutation into already generated pluripotent stem cells (iPSCs) and to subsequently validate the engineered cell model. The missense mutation D94A was introduced into the myosin regulatory light chain 2 (MYL2) of iPSCs to generate DCM-iPSC by using CRISPR-Cas9. Three different types of CRISPR, CRISPR 15 and 16 with Non-homologous end-joining (NHEJ) and CRISPR-DX1 with Ultramer, template for homology-directed repair (HDR) and CRISPR-DX1 with a donor plasmid, pGEM t easy for HDR were applied. The results show that CRISPR 15 and 16 with NHEJ and CRISPR-DX1 + Ultramer with HDR did not successfully introduce the mutation into iPSCs, whereas CRISPR-DX1 + donor plasmid engineered iPSC to express MYL2-D94A. The engineered DCM-iPSCs will be purified and used for future experiments to investigate the DCM phenotype in cardiomyocytes derived from these iPSCs. |
